PCR實(shí)驗(yàn)的污染來源都有哪些？

樣本間交叉污染：收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴(yán)導(dǎo)致外溢；不同樣本移液時(shí)忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實(shí)驗(yàn)器具及耗材未及時(shí)消毒滅菌；不同樣本同時(shí)開蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴(kuò)散，相互交叉污染。

實(shí)驗(yàn)試劑污染：主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對(duì)照及其它試劑被核酸模板或陽性對(duì)照污染。加樣過程中，因?yàn)镻CR試劑對(duì)溫度十分敏感，需要通過冰浴使得PCR試劑和PCR板/管處于0℃，但這個(gè)過程也充滿污染風(fēng)險(xiǎn)。

擴(kuò)增產(chǎn)物污染：大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)管意外開蓋，這是PCR反應(yīng)中最主要、最常見的污染問題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。

那么對(duì)于【細(xì)胞和生物制品】及其生產(chǎn)過程中【支原體】污染的檢測(cè)，有什么PCR檢測(cè)方法嗎？

• 常規(guī)PCR Kit （經(jīng)典法）(不含Taq酶）

特點(diǎn)

1.內(nèi)控對(duì)照為獨(dú)立包裝，遵循歐洲藥典和日本藥典操作流程。

2.高特異性，僅一條陽性對(duì)照條帶，即可涵蓋所有可能感染細(xì)胞的支原體物種。操作簡(jiǎn)單，

易于觀察。

3. 高靈敏度，若PCR反應(yīng)體系加入10μl樣本，支原體檢測(cè)限度為≤5或≤10CFU。

(詳見下文“(2)Venor® Gem Classic Kit 10種常見支原體檢測(cè)限“)

4.歐洲藥典要求的26種支原體均可檢出。該試劑盒可檢測(cè)出1種脲原體、7種無膽甾原體和85種支原體，與細(xì)菌和真核DNA無交叉反應(yīng)。

5.試劑盒中不含Taq酶，可另外購(gòu)買。推薦使用德國(guó)MB公司專用Taq酶。(貨號(hào): 53-1050)

Venor® Gem Classic Kit

10種常見支原體檢測(cè)限

操作步驟

第1步：樣本處理

a. 細(xì)胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說明：①樣品基質(zhì)可能會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測(cè)定靈敏度。

②細(xì)胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測(cè)靈敏度。

建議：樣本做DNA抽提處理，實(shí)現(xiàn)最高靈敏度。

推薦：德國(guó)MB公司生產(chǎn)的專用支原體DNA提取試劑盒，Venor® Gem Sample Preparation Kit。該DNA抽提試 劑盒已經(jīng)過廣泛驗(yàn)證。

第2步：試劑制備

第3步：PCR體系建立

a. 細(xì)胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

第4步：?jiǎn)?dòng)PCR反應(yīng)

第5步：電泳結(jié)果分析

191bp為內(nèi)控對(duì)照條帶，表明PCR反應(yīng)正常。

當(dāng)樣本存在支原體污染時(shí)，由于內(nèi)控對(duì)照與支原體DNA存在競(jìng)爭(zhēng)，內(nèi)控對(duì)照條帶變?nèi)酰ɡ缰гwDNA＞103拷貝）。

陽性對(duì)照中支原體DNA＞104拷貝，內(nèi)控對(duì)照條帶會(huì)*消失。

可能在80-90bp存在引物自退火形成的條帶，此條帶不影響檢測(cè)結(jié)果。

如果待測(cè)樣本對(duì)PCR產(chǎn)生抑制，則內(nèi)控對(duì)照條帶變?nèi)酰ê完幮詫?duì)照相比），此時(shí)應(yīng)先進(jìn)行DNA抽提（推薦使用：Venor® Gem Sample Preparation Kit 支原體DNA抽提試劑盒，詳見第25頁），然后再檢測(cè)。

儲(chǔ)存條件

2~8℃至少6個(gè)月。復(fù)溶后在-18℃保存。